CRISPR的工作基本原理
目前發現的CRISPR/Cas系統有三種不同類型即I型、II型和III型,它們存在于大約40%已測序的真細菌和90%已測序的古細菌中。其中II型的組成較為簡單,elisa試劑盒免費代測以Cas9蛋白以及向導RNA(gRNA)為核心組成,也是目前研究中zui深入的類型。
當細菌抵御噬菌體等外源DNA入侵時,在前導區的調控下,CRISPR被轉錄為長的RNA前體(Pre RISPR RNA,pre-crRNA),然后加工成一系列短的含有保守重復序列和間隔區的成熟crRNA,zui終識別并結合到與其互補的外源DNA序列上發揮剪切作用。
在II型系統中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9單獨參與。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白質中部的HNH2個*的活性位點,elisa試劑盒免費代測在crRNA成熟和雙鏈DNA剪切中發揮作用。此外,pre-crRNA轉錄的同時,與其重復序列互補的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA,tracrRNA)也轉錄出來,并且激發Cas9和雙鏈RNA特異性RNase III核酸酶對pre-crRNA進行加工。加工成熟后,crRNA、tracrRNA和Cas9組成復合體,識別并結合于crRNA互補的序列,然后解開DNA雙鏈,形成R-loop,使crRNA與互補鏈雜交,另一條鏈保持游離的單鏈狀態,然后由Cas9中的HNH活性位點剪切crRNA的互補DNA鏈,RuvC活性位點剪切非互補鏈,zui終引入DNA雙鏈斷裂(DSB)。CRISPR/Cas9的剪切位點位于crRNA互補序列下游鄰近的PAM區(Protospacer Adjacent Motif)的5'-GG-N18-NGG-3'特征區域中的NGG位點,而這種特征的序列在每128bp的隨機DNA序列中就重復出現一次。研究結果表明,Cas9還可以剪切線性和超螺旋的質粒,elisa試劑盒免費代測其剪切效率堪比限制性內切酶。