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熒光定量PCR試劑盒的工作原理是什么?

點擊次數:388 更新時間:2024-07-15
 
  熒光定量PCR試劑盒是一種用于定量檢測DNA或RNA的試劑盒,其工作原理主要基于聚合酶鏈式反應(PCR)和熒光探針技術。
 
  聚合酶鏈式反應(PCR)是一種在體外模擬自然DNA復制過程的技術,通過重復的變性、退火和延伸循環,使目標DNA片段呈指數級擴增。在熒光定量PCR試劑盒中,首先將待測樣品與試劑盒中的試劑混合,然后進行PCR反應。在每個循環中,目標DNA片段的數量都會增加一倍,從而使得熒光信號也隨之增強。
 
  熒光探針技術是其核心部分。在反應體系中,除了常規的PCR引物外,還加入了一段特異性的熒光標記探針。這段探針通常被設計為與目標DNA片段互補,并在其5'端標記有熒光報告基團(如FAM),在3'端標記有熒光淬滅基團(如TAMRA)。當探針與目標DNA片段結合時,報告基團和淬滅基團之間的距離變近,導致熒光信號減弱。然而,在PCR延伸階段,由于Taq酶具有5'到3'的外切酶活性,會將結合在目標DNA上的探針切斷,使得報告基團和淬滅基團分離,熒光信號得以釋放并增強。
 
  通過實時監測熒光信號的變化,可以準確地定量分析目標DNA片段的初始濃度。在熒光定量PCR試劑盒中,通常會設置一個閾值,當熒光信號達到該閾值時,所對應的循環數稱為Ct值(CycleThreshold)。Ct值與目標DNA片段的初始濃度呈負相關,即目標DNA片段越多,Ct值越小。通過與標準曲線比較,可以計算出待測樣品中目標DNA片段的初始濃度。
 
  熒光定量PCR試劑盒具有高靈敏度、高特異性、寬動態范圍和低變異系數等優點,廣泛應用于病原體檢測、基因表達分析、遺傳疾病診斷等領域。通過使用不同的熒光標記探針和引物,可以實現對多個目標DNA片段的同時檢測和定量分析。
 
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