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Western Blot基本原理

點(diǎn)擊次數(shù):2363 更新時(shí)間:2011-05-20
 

一個(gè)基因表達(dá)*結(jié)果是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)(或酶)。因此檢測(cè)蛋白質(zhì)是測(cè)定基因表達(dá)的主要標(biāo)志,檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法很多,除ELISA法外,也可用與檢測(cè)DNA和RNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意,故本法遂被延伸稱為Western(西)印跡法,該法能用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結(jié)合的專一性蛋白質(zhì)。將聚丙烯酰胺凝膠上分辨出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與*抗體共孵。*抗體專一地與待分離蛋自質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合,然后用另一種蛋自質(zhì),如135I-蛋白A或辣根過(guò)氧化物酶連接的山羊抗IgG檢測(cè)已結(jié)合上去的抗體。本法所需時(shí)間6小時(shí)或過(guò)夜。
蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳
幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行,而所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。zui常用的方法是將強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用,并通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷,由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān),因此SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關(guān)。在達(dá)到飽和的狀態(tài)下,每克多肽約可結(jié)合1.4克去污劑,借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物,則可測(cè)算出多肽鏈的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行,其電泳槽緩沖液的pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液,當(dāng)兩電極間接通電流后,凝膠中形成移動(dòng)界面,并帶動(dòng)加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復(fù)合物向前推進(jìn)。樣品通過(guò)高度多孔性的積層膠后,復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶(或稱積層)。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力,故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。
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