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| 新城疫病毒（NCV）熒光定量RT-PCR檢測試劑盒 |
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| 點擊次數：1181 更新時間：2011-09-16 |
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新城疫病毒（NCV）熒光定量RT-PCR檢測試劑盒說明書
用途： 新城疫病毒的RT-PCR體外分型檢測
檢測原理：試劑盒中含有新城疫病毒基因特異性引物和探針，當樣品中含有新城疫病毒時，提取新城疫病毒RNA通過逆轉錄和PCR反應成指數擴增，在反應過程中新城疫病毒的特異熒光探針跟靶核酸雜交, 同時被Taq酶水解, 把探針上的熒光基團和淬滅基團分開而產生熒光, 探針采用Fam熒光基團標記，從而通過其熒光增量來實時判斷新城疫病毒的存在。
技術參數：1. 符合SN/T 1686-2005《新城疫病毒中強毒株檢測方法：熒光RT-PCR法》的檢測要求，可用于禽肉、禽類組織臟器、禽類排泄和分泌物，及其泄殖腔和咽喉拭樣中新城疫病毒的檢測。
2. 靈敏度：對于接種的雞胚尿囊液，檢測的zui高稀釋度可達10-8～10-7，與雞胚病毒分離方法的靈敏度接近。定量檢測線性范圍可達10-1010拷貝/ml。
3. 特異性：采用基因序列數據庫設計，并通過系統驗證，新城疫病毒RT-PCR能夠檢測所有已知新城疫病毒毒株。對于其它禽類感染因子，本試劑盒檢測結果為陰性。
產品盒組成：（不包括新城疫病毒RNA提取試劑,用戶可采用通用型病毒RNA提取試劑盒或試劑盒推薦的提取方法。）
適用儀器：ABI7500，9600系列，MJ opticon2，Bio-Rad等熒光定量PCR儀均可。
實驗方法：1. 用戶可采用通用型病毒RNA提取試劑盒提取新城疫病毒RNA用于檢測或保存于-20℃以待檢測。
2. 將RT-PCR一步法反應液置室溫平衡，融化后取Taq HS酶和逆轉錄酶（使用前2000rpm離心10sec），按2.5U/管加入Taq HS酶，5.0U/管加入逆轉錄酶，即每個測試反應體系配制為： RT-PCR反應液18.5ul+0.5ul Taq HS酶+1ul逆轉錄酶。
3. 加入模板：若樣本提取物保存在-20℃，則在使用前置室溫解凍；陰、陽性對照使用前置室溫解凍。在每個PCR反應管中分別加入模板或陰、陽性對照各5μl，蓋好管蓋，置于PCR儀上，記錄相應的樣品號。
4. 循環條件設置：
熒光RT-PCR的反應參數為：
—— *階段，反轉錄 50℃/30 min；
—— 第二階段，預變性 94℃/2 min；
—— 第三階段，94℃/5 s，60℃/40 s，40 個循環，熒光收集設置在第三階段每次循環的退火延伸區。信號采集設為Fam熒光素。反應體系設為25μl。
結果分析：對于MJ Opticon2系列熒光定量PCR檢測儀進行結果分析時，扣除本底后再輸入1-15之間的熒光值，進行Ct值的設置或拖動基線到合適的位置以確定ct值。
對于ABI7500，9600系列熒光PCR檢測儀進行結果分析時基線的確定：取3-10或3-15個循環的熒光值，閾值設定原則為閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的zui高點，而不顯示Ct值為宜。
質控標準：陰性對照無Ct值顯示或Ct值為40，陽性對照的Ct值≤30.0，否則為實驗失敗。
結果判斷：1. 檢測樣本Ct值≤35.0時，報告陽性。
2.檢測樣本Ct值>35.0且Ct值<40時，需重復檢測一次，如果Ct值仍<40，但曲線有明顯的對數增長特性，報告本陽性，否則報告陰性。
3.樣本不顯示Ct值時，報告陰性。
試劑盒使用注意事項：1. 本試劑盒僅用于體外檢測等研究用途，開始使用前請仔細閱讀本說明書全文。
2.實驗必須嚴格分區操作：PCR前準備區——準備實驗試劑；樣本處理區——待測樣本、模板處理區；檢測區——PCR擴增檢測。
3.所用的吸頭和離心管都需要經DEPC水處理，以滅活RNA酶，75%乙醇也要用DEPC處理過的水配制。
4.試劑盒中各試劑充分融化后請短暫離心。反應液分裝時應盡量避免產生氣泡。上機前應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免污染儀器。
5.有關實驗室管理規范請參照國家相關部門頒布的基因擴增實驗室的管理規范執行。 |
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