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熒光定量PCR常見問(wèn)題及解答

點(diǎn)擊次數(shù):3999 更新時(shí)間:2012-04-24
 

熒光定量PCR常見問(wèn)題及解答

一、無(wú) Ct 值(信號(hào))出現(xiàn):

    1.反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠:一般都要在 35 個(gè)循環(huán)以上,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán),但高于45個(gè)循環(huán)會(huì)增加過(guò)多的背景信號(hào);

    2.檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤:一般采用 72℃延伸時(shí)采集熒光,Taqman 方法則一般在退火結(jié)束或延伸結(jié)束采集信號(hào);

    3.引物或探針降解:可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性;

    4.探針設(shè)計(jì)不佳:設(shè)計(jì)探針溫度低于引物,造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸;

    5.模板量少:對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣品的zui高濃度做起;

    6.模板降解:避免樣品制備中雜質(zhì)的引入以及模板反復(fù)凍融的情況發(fā)生。

二、如何確認(rèn)模板中是否含有 PCR 反應(yīng)阻害物質(zhì):

    有時(shí)RNAcDNA模板中存在對(duì)反轉(zhuǎn)錄和熒光PCR 反應(yīng)的阻害物質(zhì)。為了確認(rèn)這樣的阻害物質(zhì)的有無(wú),我們可以使用高濃度的模板按 3個(gè)梯度稀釋,并使用其進(jìn)行熒光定量 PCR 反應(yīng)。如果無(wú)阻害物質(zhì)存在,得到的 Ct 值就會(huì)依模板濃度的變化而變化;而如果模板中有阻害物質(zhì)的存在,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們就會(huì)發(fā)現(xiàn)高濃度的模板有反應(yīng)性能下降的現(xiàn)象。

三、Ct值出現(xiàn)過(guò)晚:

    1.反應(yīng)條件不佳:未*反應(yīng)條件,可重新設(shè)計(jì)引物或探針,適當(dāng)降低退火溫度,增加鎂離子濃度等;

    2.PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不夠;

    3.擴(kuò)增產(chǎn)物片段過(guò)長(zhǎng):一般采用 100200bp 的擴(kuò)增長(zhǎng)度。

四、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳:

    1.加樣存在誤差,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不呈梯度;

    2.標(biāo)準(zhǔn)品降解:標(biāo)準(zhǔn)品盡量避免反復(fù)凍融;

    3.引物或探針不佳:重新設(shè)計(jì);

    4.模板中存在抑制物,或模板濃度過(guò)高。

五、陰性對(duì)照液出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增:

    1.熒光 PCR mix 或水被污染;

    2.引物二聚體的出現(xiàn):在 35 循環(huán)后陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增屬正常情況,可配合溶解曲線進(jìn)行分析;

    3.反應(yīng)過(guò)程中探針降解:用PAGE電泳對(duì)探針進(jìn)行檢測(cè)。

六、溶解曲線不止一個(gè)主峰:

    1.引物設(shè)計(jì)不佳:避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn);

    2.引物濃度不佳:適當(dāng)調(diào)整引物濃度;

    3.退火溫度低:提高退火溫度;

    4.鎂離子濃度過(guò)高:適當(dāng)降低鎂離子濃度;

    5.模板中有基因組的污染:RNA提取過(guò)程中避免基因組 DNA 的污染,或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。

七、如何避免熒光定量PCR中基因組DNA擴(kuò)增:

    1.引物設(shè)計(jì)時(shí)避免基因組DNA擴(kuò)增;

    2.RNA提取過(guò)程中使用DNaseⅠ處理去除RNA中混有的基因組DNA。

熒光定量PCR常見問(wèn)題及解答

八、擴(kuò)增效率低:

    1.反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解;

    2.反應(yīng)條件不佳:適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法;

    3.反應(yīng)體系中有抑制物:一般為模板中引入,應(yīng)先把模板適當(dāng)稀釋,再加入到體系中,減少抑制物的影響。

九、重復(fù)性不好:

    1.加樣不準(zhǔn)確;

    2.儀器在樣品上溫度條件有差異,溫度均一性不好;

    3.模板濃度低:樣品初始濃度越低,重復(fù)性越差,應(yīng)減少樣品的稀釋倍數(shù)。

十、擴(kuò)增曲線不正常,剛進(jìn)入指數(shù)期就很快進(jìn)入平臺(tái)期并向右下彎曲:

    1.基線等設(shè)置不當(dāng):按儀器說(shuō)明書重新操作;

    2.模板量過(guò)多:當(dāng)擴(kuò)增曲線在10個(gè)循環(huán)內(nèi)起峰時(shí),應(yīng)將模板稀釋1001000倍后使用。

十一、各孔間的熒光信號(hào)如何進(jìn)行校正:

    由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發(fā)效率的差異等偶然誤差不可避免,因此儀器收集到的原始信號(hào)必須進(jìn)行歸一化校正,以消除這些因素對(duì)定量結(jié)果的影響。這種校正可以通過(guò)在反應(yīng)體系中添加額外的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn),一般采用紅色ROX熒光,稱為陽(yáng)性參比信號(hào)。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的,因此其信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)。ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性,減少孔間差異。

十二、熒光定量PCRCT值一般在多少后認(rèn)為模板沒(méi)擴(kuò)增:

    當(dāng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35時(shí),Real Time RT-PCR檢測(cè)無(wú)效,基因沒(méi)有表達(dá);當(dāng)進(jìn)入對(duì)數(shù)的循環(huán)數(shù)在 32-35 個(gè)循環(huán)時(shí),需要有至少 個(gè)重復(fù)才能判斷是否能檢測(cè)到基因的表達(dá)。

 
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