|
|
 |
|
| 多糖的提取和純化 |
|
| 點(diǎn)擊次數(shù)：5976 更新時(shí)間：2012-05-02 |
| |
多糖的提取和純化 多糖的提取和純化摘 要 本文較詳細(xì)地介紹了多糖的提取和純化方法，為多糖的研究和提供參考依據(jù)。
關(guān)鍵詞 多糖；提取；純化；活性炭多糖（polysacharides，PS），又稱多聚糖，是由10個(gè)以上的單糖通過苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化合物。它廣泛分布于自然界高等植物、藻類、微生物（細(xì)菌和真菌）與動(dòng)物體內(nèi)。20世紀(jì)60年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的、多方面的生物活性和功能：（1）多糖可作為廣譜免疫促進(jìn)劑，具有免疫調(diào)節(jié)功能，能治療風(fēng)濕病、慢性病毒性肝炎、癌癥等免疫系統(tǒng)疾病，甚至能抗AIDS病毒。如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強(qiáng)人體免疫功能。（2）多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗輻射，增強(qiáng)免疫功能等生物學(xué)作用[6]，麥冬多糖具有降血糖及免疫增強(qiáng)作用，動(dòng)物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能。（3）多糖能控制細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、抗過敏、降血脂、止咳祛痰、減肥等功能。
另外，多糖作為藥物，其毒性極小，因而多糖的研究已引起人們極大的興趣。
由于多糖具有的生物活性與其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，而多糖的結(jié)構(gòu)又是相當(dāng)復(fù)雜的，所以在這一領(lǐng)域的研究相對緩慢。但人們在多糖的分離提取與純化方面已做出了不少工作。1. 多糖的提取1.1 熱水浸提法：1.1.1多糖提取條件的優(yōu)選根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：影響熱水浸提多糖的因素主要有提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑體積、浸提溫度、pH值、醇析濃度和植物顆粒大小等。在試驗(yàn)前對上述多種因素利用正交實(shí)驗(yàn)法做出優(yōu)選，才能選出*提取方案。1.1.2其步驟為：原料→粉碎→脫脂→粗提（2－3次）→吸濾或離心→沉淀→洗滌→干燥首先除去表面脂肪。原料經(jīng)粉碎后加入甲醇、yi醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇yi醚混合液，水浴加熱攪拌或回流1－3小時(shí)，脫脂后過濾得到的殘?jiān)话阌盟魅軇ㄒ灿杏脷溲趸泬A性水液、氯化鈉水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氫氧化鈉作為提取溶劑）提取多糖。溫度控制在90－100℃，攪拌4－6小時(shí)，反復(fù)提取2－3次。得到的多糖提取液大多較粘稠，可進(jìn)行吸濾。也可用離心法將不溶性雜質(zhì)除去，將濾液或上清液混合（得到的多糖若為堿性則需要中和）。然后濃縮，再加入2－5倍低級醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入費(fèi)林氏溶液或硫酸銨或溴化十六烷基*基銨等，與多糖物質(zhì)結(jié)合生成不溶性絡(luò)合物或鹽類沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和yi醚洗滌。將洗干后疏松的多糖迅速轉(zhuǎn)入裝有五氧化二磷和氫氧化鈉的真空干燥器中減壓干燥（若沉淀的多糖為膠狀或具粘著性時(shí)，可直接冷凍干燥）。干燥后可得粉末狀的粗多糖。1.2 微波輔助提取法：其原理為利用不同極性的介質(zhì)對微波能的不同吸收程度，使基體物質(zhì)中的某些區(qū)域和萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使萃取物質(zhì)從基體或體系中分離出來，進(jìn)入到介電常數(shù)小，微波吸收能力較差的萃取劑中。由于微波能極大加速細(xì)胞壁的破裂，因而應(yīng)用于中草藥中有效成分的提取能極大加快提取速度，增加提取產(chǎn)率。而且由于其選擇性好，提取后基體能保持良好的性狀，提取液也較一般的提取方法澄清。聶金源等在柴胡多糖和黃酮化合物的提取中對微波輔助提取法、超聲輔助法和索氏提取法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)微波輔助提取法所需時(shí)間zui短（10min），多糖的提取率zui高（28.46％）。1.3 超聲輔助法：其原理是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超聲波的次級效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，利于提取。超聲波輔助法與常規(guī)提取法相比，具有提取時(shí)間短、產(chǎn)率高、無需加熱等優(yōu)點(diǎn)。1.4 索氏提取法： 將植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃條件下提取至無色（一般為6小時(shí)）。過濾，濾渣揮發(fā)干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小時(shí)，過濾，濾渣乙醇揮發(fā)干燥后加蒸餾水。回流提取2次，趁熱過濾，濾液減壓濃縮，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，稱重。1.5 醇提法：先后將90%和50%乙醇加入植物粉末中，振蕩充分再抽濾。濾液中加入足量無水乙醇，至于4℃冰箱中過夜。減壓抽濾，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通風(fēng)干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。醇提法方法簡單，易于操作，但提取率較低，乙醇使用量大，不宜大規(guī)模提取使用。1.6 其它方法：多糖的提取方法還有稀堿液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀堿條件下，易使多糖發(fā)生糖苷鍵的斷裂，部分多糖發(fā)生水解而使多糖的提取率減少，因而很多試驗(yàn)中避免采用稀堿液浸提法和稀酸液浸提法。2. 多糖的純化2.1 多糖中雜質(zhì)除去方法 粗多糖中往往混雜著蛋白質(zhì)、色素、低聚糖等雜質(zhì)，必須分別除去。2.1.1 除蛋白質(zhì)采用醇沉或其它溶劑沉淀所獲得的多糖，常混有較多的蛋白質(zhì)，脫去蛋白質(zhì)的方法有多種：如選擇能使蛋白質(zhì)沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣質(zhì)等試劑來處理，但用酸性試劑宜短，溫度宜低，以免多糖降解。常用的方法有：2.1.1.1 沙維積法（Sevag法）：根據(jù)蛋白質(zhì)在等有機(jī)溶劑變性而不溶與水的特點(diǎn)，將多糖水溶液、、戊醇（或正丁醇）之比調(diào)為25:5:1或25:4:1，混合物劇烈振搖20到30分鐘，蛋白質(zhì)與－戊醇（或正丁醇）生成凝膠物而分離，然后離心，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。此種方法較溫和，在避免降解上有較好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取實(shí)驗(yàn)中要重復(fù)處理達(dá)三十幾次。并且每次除去蛋白質(zhì)變性膠狀物時(shí)，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白聚糖和糖蛋白，在處理時(shí)會(huì)沉淀下來，造成多糖的損失。如能配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶，再用Sevage法效果更佳。2.1.1.2 三氟三氯乙烷法：多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合，低溫下攪拌10min左右，離心得上面水層，水層繼續(xù)用上述方法處理幾次，即得無蛋白質(zhì)的多糖溶液，此法效率高，但溶劑沸點(diǎn)較低，易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用。2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸，直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，在5－10℃放置過夜，離心除去沉淀即得無蛋白質(zhì)的多糖溶液。此法會(huì)引起某些多糖的降解。 Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三種方法均不適合糖肽，因糖肽也會(huì)像蛋白質(zhì)那樣沉淀出來。對于對堿穩(wěn)定的糖蛋白，在硼氫化鉀存在下，用稀堿溫和處理，可以把這種結(jié)合蛋白質(zhì)分開。2.1.1.4 酶解法：在樣品溶液中加入蛋白質(zhì)水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶等，使樣品中的蛋白質(zhì)降解。通常將其與Sevag法綜合使用除蛋白質(zhì)效果較好。2.1.1.5 鹽酸法：取樣品濃縮液，用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)其PH至3，放置過夜，在3000r/min條件下離心，棄去沉淀，即脫去蛋白質(zhì)。 另有人分別在植物多糖實(shí)驗(yàn)中證明：鹽酸法、三氯yi酸法及Sevag法脫蛋白率分別為72.5％、46.1％和42.3％，多糖的損失率分別為15.1%、6.1％和14.3％。鹽酸法脫蛋白率高，但多糖的損失率也較高;三氯yi酸法較溫和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脫蛋白效果不及前兩種。2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和飽和Ba（OH）2溶液，振蕩后離心去蛋白。此法除蛋白不夠*，可結(jié)合Sevag法使用。還可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉淀*，在4000r/min的條件下離心10min，收集上清液，即為除蛋白液。還有人使用4:1的-乙醇溶液除蛋白，將混合液清搖，再靜置，取上清液。此過程需重復(fù)多次方可除盡蛋白。除去蛋白質(zhì)的樣品用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)，觀察在280mm處是否有吸收，如果無吸收則表明蛋白質(zhì)已經(jīng)除盡。2.1.2 除色素2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素：活性炭屬于非極性吸附劑，有著較強(qiáng)的吸附能力，特別適合于水溶性物質(zhì)的分離。它的來源充足，價(jià)格便宜，上柱量大，適用于大量制備性分離。目前用于色譜分離的活性炭主要分為粉末狀活性炭、顆粒狀活性炭、錦綸活性炭三種。一般情況下，盡量避免用活性炭處理，因?yàn)榛钚蕴繒?huì)吸附多糖，造成多糖的損失。2.1.2.2對于植物來源的多糖，可能含有酚型化合物而顏色較深，這類色素大多呈負(fù)性離子，不能用活性炭吸收劑脫色，可用弱堿性樹脂DEAE纖維素或DuoliteA－7來吸附色素。2.1.2.3若糖和色素時(shí)結(jié)合的，易被DEAE纖維素吸附，不能被水洗脫，這類色素可進(jìn)行氧化脫色：以濃氨水或NaOH液調(diào)至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至淺黃色，保溫2小時(shí)。2.1.2.4 依次用丙酮、無水yi醚和無水乙醇洗滌多糖，即可得到較為純凈的多糖。此法較為簡單，便于操作，多糖損失也較小。2.1.2.5 用4:1的-正丁醇除色素。操作簡單，多糖有一定損失。2.1.2.6發(fā)酵來源的多糖顏色一般較淺，色素含量較少，一般可不除色素。2.1.2.7對于動(dòng)物，微生物等提取得到的多糖也可根據(jù)不同情況按上述方法處理。2.1.3 除低聚糖等小分子雜質(zhì)2.1.3.1采用逆向流水透析法。即準(zhǔn)備好一桶蒸餾水，用一根導(dǎo)管將水通入透析袋的燒杯底部，另用一根導(dǎo)管將水引出，根據(jù)水量控制流速，使水緩慢流動(dòng)48小時(shí)。這樣得到的就是多糖的半精品。2.1.3.2利用溶液濃度擴(kuò)散效應(yīng)，將分子量小的物質(zhì)如無機(jī)鹽、低聚糖等從透析袋滲透到袋外的蒸餾水中，不斷換水即可保持濃度差，從而除盡小分子雜質(zhì)。具體的做法是根據(jù)多糖溶液的體積截取相應(yīng)長度的透析袋，用透析夾夾住一端，灌入多糖液，離液面2－3cm處夾緊透析袋，置于一大燒杯中，注入蒸餾水至*浸沒透析袋后，用磁力攪拌器慢速攪拌，每12小時(shí)換一次水，重復(fù)3－4次。2.2 多糖的純化方法 純化是將多糖混合物分離為單一多糖的過程，純化的方法主要有以下幾種：2.2.1 分部沉淀法 根據(jù)各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質(zhì)，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉淀，經(jīng)反復(fù)溶解與沉淀后，直到測得的物理常數(shù)恒定（zui常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合于分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩(wěn)定，常在pH7進(jìn)行，唯酸性多糖在pH7時(shí)－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進(jìn)行分離，為了防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖制成各種衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后將多糖衍生物溶于醇中，zui后加入yi醚等極性更小的溶劑進(jìn)行分級沉淀分離。2.2.2 鹽析法 在天然產(chǎn)物的水提液中，加入無機(jī)鹽，使其達(dá)到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，與其它水溶性較大的雜質(zhì)分離。常做鹽析的無機(jī)鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
2.2.3 季銨鹽沉淀法 季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物并不與中性多糖產(chǎn)生沉淀，但當(dāng)溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時(shí)，也會(huì)與中性多糖形成沉淀。常用的季銨鹽有十六烷基*胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉淀出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會(huì)被沉淀出來。2.2.4 柱層析：包括纖維素柱層析、纖維素陰離子交換柱層析、凝膠柱層析、親和層析、高壓液相層析和其它柱層析。如用活性炭及硅膠做載體的柱層來分離多糖；或用硼砂型的離子交換樹脂分離中性多糖。纖維素柱層析 纖維素柱層析對多糖的分離既有吸附色譜的性質(zhì)，又具有分配色譜的性質(zhì)，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先后順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的zui后出柱，與分級沉淀法正好相反。纖維素陰離子交換柱層析 zui常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或堿型），洗脫劑可用不同濃度的堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前zui為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適于分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。凝膠柱層析 凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯酰胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強(qiáng)度不低于0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的后出柱。由于糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質(zhì)的分離有很大的差別。在多糖分離時(shí)，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機(jī)鹽及小分子化合物，然后再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進(jìn)行分離。凝膠柱層析法不適合于粘多糖的分離。親和層析 用凝聚素（一般是蛋白質(zhì)和糖蛋白）做親和色譜來分離多糖。高壓液相層析2.2.5 制備性區(qū)域電泳 分子大小、形狀及所負(fù)電荷不同的多糖其在電場的作用下遷移速率是不同的，故可用電泳的方法將不同的多糖分開，電泳常用的載體是玻璃粉。具體操作是用水將玻璃粉拌成膠狀、柱狀，用電泳緩沖液（如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3）平衡3天，將多糖加于柱上端，接通電源，上端為正極（多糖的電泳方向是向負(fù)極的），下端為負(fù)極，其單位厘米的電壓為1.2－2V，電流30－35MA，電泳時(shí)間為5－12小時(shí)。電泳完畢后將玻璃粉載體推出柱外，分割后分別洗脫、檢測。該方法分離效果較好，但只適合于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模使用，且電泳柱中必須有冷卻夾層。2.2.6 金屬絡(luò)合物法 常用的絡(luò)合劑有費(fèi)林溶液、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等。2.2.7 其它方法：純化除采用上述方法外，還有超過濾法（多糖溶液通過各種已知的超過濾膜就能達(dá)到分離）、活性炭柱色譜。另據(jù)報(bào)道，國外多采用的LKB柱色譜系統(tǒng)，用比旋度、示差折射及紫外檢測多糖，各組分的峰位自動(dòng)記錄，分離效果好且方便。2.3 多糖純度的鑒定2.3.1超離心法 由于微粒在離心力場中移動(dòng)的速度與微粒的密度、大小和形狀有關(guān)，故當(dāng)將多糖溶液進(jìn)行密度梯度超離心時(shí)，如果是組分均一的多糖，則應(yīng)呈現(xiàn)單峰。具體的做法是將多糖樣品用0.1molNaCl或0.1molTris鹽緩沖溶液配制成1％－5％的溶液，然后進(jìn)行密度超離心，待轉(zhuǎn)速達(dá)到恒定后（通常是60000r/min），采用間隔照明的方法檢測其是否為單峰。2.3.2高壓電泳法 由于中性多糖導(dǎo)電性差、分子量大、在電場中的移動(dòng)速度慢，故常將其制成硼酸絡(luò)合物進(jìn)行高壓電泳。多糖的組成不同、分子量不同，其與硼酸形成的絡(luò)合物就不同，在電場作用下的相對遷移率也會(huì)不同，故可用高壓電泳的方法測定多糖的純度。通常高壓電泳所用的支持體是玻璃纖維紙、純絲綢布、聚丙酰銨凝膠、纖維素醋酸酯薄膜等。緩沖液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液，電壓強(qiáng)度約為30－50V/cm，時(shí)間是30－120min。由于電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的熱，所以要有冷卻系統(tǒng)，將溫度維持在0℃左右，否則會(huì)燒掉支持體。一般單糖、低聚糖因醛基而發(fā)生的顏色反應(yīng)在多糖上不明顯，電泳后常用的顯色劑是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和過碘酸希夫試劑等。2.3.3凝膠柱層析 常用的凝膠是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展開劑為0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶與0.02醋酸1：1的緩沖溶液，柱高和柱直徑之比大于40。2.3.4旋光測定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其濃度為10％左右，離心得沉淀。上清液再加入乙醇使其濃度為20％－25％，離心所得二次沉淀，比較二次沉淀的比旋度。如果比旋度相同則為純品，否則為混合物。2.3.5其它方法：官能團(tuán)摩爾比恒定法，即如為純品兩次分離所得產(chǎn)物的官能團(tuán)如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩爾比應(yīng)該恒定。類似的方法還有示查折射法、HPLC法等。此外德國常用高壓液相法來檢測多糖純度，結(jié)果可靠。 必須注意的是：純度檢查一般要求有上述兩種方法以上的結(jié)果才能肯定。
|
|
| |
|
|
員_a.png)