PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化,此時(shí)即為基線期。 PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺(tái)期”。在該時(shí)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無(wú)線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點(diǎn): 產(chǎn)品僅用于科研使用簡(jiǎn)便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價(jià)格便宜; 熒光染料的缺點(diǎn): 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會(huì)影響檢測(cè)的敏感性 非特異性產(chǎn)物會(huì)影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問(wèn)題可以通過(guò)熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識(shí)別,進(jìn)而通過(guò)PCR引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來(lái)說(shuō),SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)手段。 產(chǎn)品名稱 | 頭孢霉屬通用探針?lè)晒釶CR檢測(cè)試劑盒 | 英文名稱 | Cephalosporium spp. | 貨號(hào) | YSP96529 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí),引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí),Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來(lái),從而使其發(fā)出熒光。檢測(cè)到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問(wèn)題,反應(yīng)結(jié)束后無(wú)需通過(guò)熔解曲線檢測(cè),縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點(diǎn): 成本高; 設(shè)計(jì)難度大; 只能用于檢測(cè)產(chǎn)物長(zhǎng)度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來(lái)也叫Real-Time PCR,是美國(guó)PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 硬脂酸(Standard for GC,>99%(GC))Myc-Tag (9B11) Mouse mAb2-氨基-3,5-二氯吡 乙(Standard for GC,>99.5%(GC))Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb羥基 環(huán)丁砜(標(biāo)準(zhǔn)品)Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb溴芐 環(huán)丁砜(Standard for GC,≥99.5%(GC))Myc-Tag (9B11) Mouse mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)1,二甲基脲嘧啶 十四烷(Standard for GC,>99%(GC))Raptor (24C12) Rabbit mAb溴-2- 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)(standard for GC,≥99.0%(GC))Raptor (24C12) Rabbit mAb5-溴-1H-吡唑[3,B]吡啶 酸三丁酯(standard for GC,>99.5%)SPAK Antibody羥基-乙酮 三氯乙(Standard for GC,>99.5%)DAP1 Antibody5-溴吲哚-甲 三乙(Standard for GC,≥99.5%(GC))SCD1 (R347) Antibody(S)-1-(2,6-二氯-氟基)乙 1,2,3,四氫萘(THN)(Standard for GC, ≥99.5% (GC))Cathepsin D Antibody吲哚乙酰 四(Standard for GC,>99.9(GC))Thioredoxin 1 Antibody (Human Specific)2-羥基-2-甲基-1-基-1-酮 三(TFA)(Standard for GC,≥99.5%(GC))LEF1 (C18A7) Rabbit mAb2-硝基咪唑 1,2,三氯(Standard for GC, ≥99.5% (GC))NUP98 (L205) Antibody噻吩甲酸 四氯乙(Standard for GC,≥99.9%(GC))PP5 Antibody3,5-二溴-氨基三氟甲氧基 酸三乙酯(P)(Standard for GC,>99.7%(GC))PP2A B Subunit (100C1) Rabbit mAb鄰氯三氟甲 三乙四(TA)(Standard for GC)PP2A B Subunit (100C1) Rabbit mAb氯氧異丁酸 1,3,5-*(Standard for GC, ≥99.0% (GC))NUP98 (P671) Antibody2-氯-5-氟煙酸 三正丁(Standard for GC,≥99.5%(GC))IQGAP1 AntibodyN-Boc-(S)-甲酸哌啶 頭孢霉屬通用探針?lè)晒釶CR檢測(cè)試劑盒STAT3蛋白抑制分子(PIAS3)ELISA試劑盒Ly-6G/Gr-1 淋巴細(xì)胞抗原6G抗體100 ug Spondin-2 ELISA試劑盒LY-86/MD-1 MD-1蛋白抗體100 ul SPARC相關(guān)模塊化鈣結(jié)合蛋白2(SMOC2)ELISA試劑盒LY-96/MD-2 MD-2蛋白抗體20 ul SPARC相關(guān)模塊化鈣結(jié)合蛋白1(SMOC1)ELISA試劑盒Lysozyme 溶菌酶抗體100 ul SMAD3 ELISA試劑盒Lyn 膜相關(guān)蛋白酪氨酸激酶Lyn抗體100 ul SMAD2 ELISA試劑盒Phospho-Lyn (Tyr507) 膜相關(guān)蛋白酪氨酸激酶Lyn抗體100 ul SHC轉(zhuǎn)化蛋白1(SHC1)ELISA試劑盒Phospho-Lyn (Tyr396) 酸化膜相關(guān)蛋白酪氨酸激酶Lyn抗體100 ul SH2攜帶蛋白(SHC/SLP-76)ELISA試劑盒Phospho-Lyn (Tyr497) 酸化膜相關(guān)蛋白酪氨酸激酶Lyn抗體100 ul Seryl- tRNA合成酶,細(xì)胞質(zhì)(SARS/SERS)ELISA試劑盒LYVE-1 淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體抗體100 ul |