PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺期”。在該時期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 無色桿菌屬通用探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Achromobacter spp. | 貨號 | YSP96329 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 酸氯倍他索C22H18O111-(氨基基)吡咯烷 克羅拉濱/氯法拉濱C21H20O10(R)-2-氨基己烷 克霉唑C10H18O氨基*氧基硅烷 克霉唑(標(biāo)準(zhǔn)品)C26H32O14氨基三乙氧基硅烷 秋水仙堿C7H6O5聚(甲基氫硅氧烷) 秋水仙堿(標(biāo)準(zhǔn)品)C33H52O51--1H,1H,2H,2H-全氟辛烷 硫酸粘桿菌素,多粘菌素E硫酸鹽C12H16O22-苯氧基溴乙烷 硫酸粘桿菌素(標(biāo)準(zhǔn)品)C12H16O4代*基硅烷 吡啶硫酮銅C28H32O15二烷 鹽酸依氟鳥氨酸C36H58O10苯己烷 色甘酸鈉C11H14O3溴 色甘酸鈉(標(biāo)準(zhǔn)品)C29H36O155-溴-5-硝基-1,二惡烷 環(huán)孢菌素,環(huán)孢素A,環(huán)孢霉素AC20H24O91-溴-5-氯戊烷 環(huán)孢菌素,環(huán)孢素A,環(huán)孢霉素A(標(biāo)準(zhǔn)品)C20H24O111-溴-6-氯己烷 鹽酸噻氯匹定C20H24O101-溴-氯丁烷 鹽酸噻氯匹定(標(biāo)準(zhǔn)品)C22H24O61-溴-2-氯乙烷 阿糖胞苷(進(jìn)分)C22H20O111,2-環(huán)氧辛烷 阿糖胞苷C21H20O10環(huán)氧環(huán)己烷 無色桿菌屬通用探針法熒光PCR檢測試劑盒豬補體蛋白3(C3)ELISA試劑盒Acetyl CoA Carboxylase 乙酰輔酶A羧化酶抗體100 ul 豬表皮生長因子(EGF)ELISA試劑盒Phospho-Acetyl CoA Carboxylase(Ser79) 磷酸化乙酰輔酶A羧化酶抗體100 ug 豬表達(dá)于SiSo細(xì)胞系的受體結(jié)合型腫瘤抗原(EBAG9)ELISA試劑盒ACD 腎上腺皮質(zhì)發(fā)育異常蛋白抗體100 ug 豬白血病抑制因子受體(LIFR)ELISA試劑盒AchE 乙酰膽堿酶抗體100 ug 豬白三烯B4(LTB4)ELISA試劑盒Acinus Acinus抗體100 ug 8(IL-8/CXCL8)ELISA試劑盒phospho-Acinus(Ser1180) 磷酸化腺泡Acinus蛋白抗體100 ul 6(IL-6)ELISA試劑盒Ack1 醋酸激酶1抗體100 ug 4(IL-4)ELISA試劑盒Phospho-Ack1(Tyr857/858) 磷酸化Ack1抗體1Kit 3(IL-3)ELISA試劑盒Phospho-Ack1(Tyr284) 磷酸化Ack1抗體100 ug |