PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進(jìn)行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 氣單胞菌通用探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Aeromonas spp. | 貨號 | YSP96357 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 阿德福韋/阿德福韋酯C30H26O123,6-二羥基萘-2,7-二磺酸二鈉 阿德福韋/阿德福韋酯(標(biāo)準(zhǔn)品)C45H38O18D-對羥基苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽 R-鹽酸普拉克索C19H14NO4Cl2,二溴苯酚 氯氮平C23H28O136-溴-二氫色原酮 氯氮平(標(biāo)準(zhǔn)品)C15H14O6·H2O2-溴-氟苯甲 恩諾沙星C9H10O4氯肉桂 恩諾沙星(標(biāo)準(zhǔn)品)C5H9NO2N,N-二甲基脲 鹽酸恩諾沙星C32H36O122,3,4,5-四氟苯胺 鹽酸恩諾沙星(標(biāo)準(zhǔn)品)C37H42N2O6氟- 佐米曲普坦C21H22O4丁酸香茅酯 胸腺肽alpha 1C16H14O55-降冰片烯-2-甲 替加氟C21H22O47-氨基庚酸乙酯鹽酸鹽 替加氟(標(biāo)準(zhǔn)品)C37H42N2O6·ClHO4磺酸 阿昔莫司,阿西莫司C37H42N2O6·(HClO4)25--1-甲基-1H-咪唑 阿昔莫司,阿西莫司(標(biāo)準(zhǔn)品)C37H42N2O62-溴-5-三氟甲氧基苯胺 阿達(dá)帕林C38H44N2O6草酸鋰 阿達(dá)帕林(標(biāo)準(zhǔn)品)C10H16O左氧氟沙星 阿德福韋C29H36O15(4R,5R)-2,2-二甲基-a,a,a',a'-四苯基-1,二氧戊環(huán)-4,5-二甲 氣單胞菌通用探針法熒光PCR檢測試劑盒免疫球蛋白M(IgM)ELISA試劑盒BGP 骨保護(hù)蛋白/骨鈣素抗體100 ul 免疫球蛋白G4(IgG4)ELISA試劑盒Bid BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白抗體20 ul 免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒BIN1 橋連整合因子蛋白抗體100 ul 免疫球蛋白E(IgE)ELISA試劑盒Bim 細(xì)胞死亡調(diào)解子抗體300 ul 免疫球蛋白D(IgD)ELISA試劑盒phospho-Bim(Ser87) 磷酸化細(xì)胞死亡調(diào)解子抗體100 ul 免疫球蛋白A(IgA)ELISA試劑盒phospho-Bim(Ser55) 磷酸化細(xì)胞死亡調(diào)解子抗體100 ul 輪狀病毒(RV)抗原(Ag)ELISA試劑盒phospho-Bim(Ser69) 磷酸化細(xì)胞死亡調(diào)解子抗體100 ul 卵清蛋白特異性IgG(OVA sIgG)ELISA試劑盒BIRC5/Survivin variant 細(xì)胞凋亡抑制因子5抗體100 ul 卵清蛋白特異性IgE(OVA sIgE)ELISA試劑盒BK channel BK通道蛋白抗體100 ul |