PCR技術的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應過程中產生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產物量與起始模板量之間無線性關系,所以根據(jù)終的PCR產物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產物結合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產物會影響結果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎也的Real-time qPCR實驗手段。 產品名稱 | 嗜水氣單胞菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Aeromonas hydrophila | 貨號 | YSP96353 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結合到模板上,探針的結合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術解決了熒光染料與非特異性擴增結合的問題,反應結束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術的缺點: 成本高; 設計難度大; 只能用于檢測產物長度低于150bp的反應。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術。該技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應的進行,PCR反應產物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產物量的變化。而在平臺期,擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系,根據(jù)終的 PCR 產物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 醋酸地塞米松(標準品)C25H24O122,6-二氟對甲氧基苯 甲氧芐啶C25H24O123,5-二叔丁基-羥基苯甲酸 甲氧芐啶(標準品)C42H68O13乙酸異丁酯 西維來司鈉C30H48O51-萘乙酸鈉 奈韋拉平C7H10O52-甲氧基吡啶-酸 奈韋拉平(標準品)C20H22O6乙酰乙酸對硝基芐酯 磺胺甲惡唑C10H10O4雙氯芬酸鈉 磺胺甲惡唑(標準品)C22H22O9氟-硝基溴芐 硫酸頭孢匹羅C15H14O7(R)-(+)-2-乙酰氧基丁二酸酐 硫酸頭孢匹羅(標準品)C15H14O72-乙苯 阿米舒必利C22H22O102-甲基-4,6-二羥基嘧啶 阿米舒必利(標準品)C20H24NO42,二胺-6-磺酸 非諾貝特酸C39H50O201,1-環(huán)己基二乙酸酐 非諾貝特酸(標準品)C15H24O22,6-二氯-酚 鹽酸莫西沙星C65H106O32溴-2-羥基苯甲酸 鹽酸莫西沙星(標準品)C20H24O106-羥基煙酸乙酯 昔美酸沙美特羅C7H6O32-氯-氟芐 萘普生C42H65NO16(甲氧基苯基)(哌啶)甲酮鹽酸鹽 嗜水氣單胞菌探針法熒光PCR檢測試劑盒凝血因子Ⅺ(FⅪ)ELISA試劑盒B7H4 B7-H4抗體100 ul 凝血因子Ⅹ(FⅩ)ELISA試劑盒BACE/ASP2 β分泌酶抗體20 ul 凝血因子Ⅸ(FⅨ)ELISA試劑盒Bad 相關死亡促進因子Bad抗體100 ul 凝血因子Ⅷ(FⅧ)ELISA試劑盒Bad 相關死亡促進因子Bad抗體100 ul 凝血因子Ⅶ(FⅦ)ELISA試劑盒phospho-BAD(Ser128) 磷酸化相關死亡促進因子抗體100 ul 凝血因子Ⅵ(FⅥ)ELISA試劑盒phospho-BAD(Ser75/99/118) 磷酸化相關死亡促進因子抗體1 Kit 凝血因子Ⅴ(FⅤ)ELISA試劑盒Bag1/RAP46 抑凋亡基因bag1抗體100 ul 凝血因子Ⅳ(FⅣ)ELISA試劑盒Bak Bcl-2同源拮抗劑抗體300 ul 凝血因子Ⅲ(FⅢ)ELISA試劑盒BADH2 BADH2抗體(水稻)100 ul |