PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 犬細小病毒探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Canine Parvo Virus(CPV) | 貨號 | YSP96515 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 乙酰標準溶液(10μg/ml,基體:酮)NGF Antibody2,二甲基-1-戊 Amberli® XAD16非離子型大孔樹脂(20-60 mesh)CENP-A (C5H3) Rabbit mAb (Mouse Specific)大麥芽硫酸鹽 甲草(標準品)CENP-A (C51A7) Rabbit mAb (Mouse Specific)2,4'-二溴乙酮 甲草標準溶液(100μg/ml,u=3%)Tug Antibody2-異基酸 甲草標準溶液(549mg/L,基體:甲)SimpleChIP® Human PTMA Downstream Primers肼基甲酸 殺螟丹(標準品)Phospho-PKD/PKCμ (Ser916) Antibody2-乙基-4,5-二甲基噻唑 殺螟丹標準溶液(100μg/ml,u=3%)Phospho-PKD/PKCμ (Ser916) Antibody1,8-二乙酰氧基辛烷 殺螟丹標準溶液(10μg/ml,u=3%)Phospho-PKD/PKCμ (Ser916) AntibodyE-PENN-1-YLBORONIC ACID 莎稗(標準品)Phospho-PKD/PKCμ (Ser744/748) AntibodyN-FMOC-1-氨基環(huán)烷羧酸 乙草(標準品)Phospho-PKD/PKCμ (Ser744/748) Antibody5-AMINO-CYA-(2-CHLOROPHENYL)-METHYLPYRAZOLE 乙草標準溶液(100μg/ml,u=2%)Phospho-PKD/PKCμ (Ser744/748) Antibody氨基-2,6-二甲基嘧啶 乙草標準溶液(10μg/ml,u=3%)Phospho-PKCdelta (Tyr311) Antibody1-甲基環(huán)烷-1-羧酸 三唑錫(標準品)PKCα Antibody二酚硫酸二鹽二水合物 Amberli® IRA410 離子交換樹脂(719(202)是高等級凝膠強Ⅱ型陰離子交換樹脂)PKCα Antibody辛乙二單正十二烷基酯 酸二氫銨(分析標準品,用于凱氏定氮法氮測定,≥99.5%)TIGIT (E6L7H) Rabbit mAb1,二異基 酸二氫銨(for HPLC,≥99.0%(T))PKCδ Antibody反式-2-癸酸乙酯 Amberli XAD7HP 離子交換樹脂(Mesh 20-60)Phospho-LIN28A (Ser200) (D5I6X) Rabbit mAb1-(BROMOPHENYLSULFONYL)-2-METHYL-1H-IMIDAZOLE Amberli XAD-4 非離子型大孔樹脂(粒徑0.49 - 0.69 mm)Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit mAb2-基 犬細小病毒探針法熒光PCR檢測試劑盒白喉抗體(Diphtheria Ab)ELISA試劑盒Kif14 proin 驅(qū)動蛋白家族Member14蛋白抗體100 ul 八聚體轉(zhuǎn)錄因子(OTF2B)ELISA試劑盒KIF17 驅(qū)動蛋白家族KIF17抗體100 ul 八聚體轉(zhuǎn)錄因子(OTF2A)ELISA試劑盒Kiss-1 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因抗體100 ul 艾柯病毒IgM(ECHO IgM)ELISA試劑盒Klf4 腸道內(nèi)富含的Kruppel樣因子/上皮鋅指蛋白4抗體100 ul 艾柯病毒IgG(ECHO IgG)ELISA試劑盒KLF5 腸道內(nèi)富含的Kruppel樣因子5抗體100 ul 艾杜糖硫酸酯酶(IDS)ELISA試劑盒phospho-Kinesin 5B (Ser272) 酸化Kinesin 5B抗體100 ul 癌癥促凝素(CP)ELISA試劑盒phospho-Kinesin 5B (Ser275) Kinesin 5B抗體20 ul 癌抗原27-29(CA 27-29)ELISA試劑盒KLF2 肺Kruppel樣因子抗體100 ul 癌基因蛋白質(zhì)p190/bcr-abl ELISA試劑盒KLF6 轉(zhuǎn)染抑癌基因KLF6抗體100 ul |