PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時(shí)即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺(tái)期”。在該時(shí)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點(diǎn): 產(chǎn)品僅用于科研使用簡(jiǎn)便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價(jià)格便宜; 熒光染料的缺點(diǎn): 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會(huì)影響檢測(cè)的敏感性 非特異性產(chǎn)物會(huì)影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識(shí)別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)手段。 產(chǎn)品名稱 | 戈氏放線菌探針法熒光PCR檢測(cè)試劑盒 | 英文名稱 | Actinomyces gerencseriae | 貨號(hào) | YSP96340 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí),引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí),Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測(cè)到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測(cè),縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點(diǎn): 成本高; 設(shè)計(jì)難度大; 只能用于檢測(cè)產(chǎn)物長(zhǎng)度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國(guó)PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 紫杉(標(biāo)準(zhǔn)品)C31H42O172-溴-2',4'-二氯苯乙酮 鹽酸帕洛諾司瓊C21H22O5聚丁二酸(羥基-2,2,6,6-四甲基-1-哌啶乙)酯;光穩(wěn)定劑622 硫酸巴龍霉素C21H24O9阿那曲唑 硫酸巴龍霉素(標(biāo)準(zhǔn)品)C31H43NO10氟-2- 甲磺酸帕珠沙星C32H45NO10羥基-三氟甲 甲磺酸帕珠沙星(標(biāo)準(zhǔn)品)C22H28O6氯新戊酰氯 甲磺酸培氟沙星C30H48O45-茚 甲磺酸培氟沙星(標(biāo)準(zhǔn)品)C16H12O52-溴吡啶-甲酸甲酯 培美曲塞二鈉C15H10O5苯甲酰胞苷 培美曲塞二鈉(標(biāo)準(zhǔn)品)C30H48O42-氯-甲氧基苯酸 酞磺胺噻唑C21H20O65-氨基-2-氟苯甲酸 匹格列酮C30H48O51-[氨基-氯-5-(三氟甲基)苯基]乙酮 匹格列酮(標(biāo)準(zhǔn)品)C32H48O9氟-2-甲氧基-6-甲基吡啶 匹格列酮鹽酸鹽C30H48O45-羥基-2-吡啶甲酸甲酯 匹格列酮鹽酸鹽(標(biāo)準(zhǔn)品)C30H48O31-甲基環(huán)戊 苯噻啶蘋果酸鹽C21H30O5硫酸鈰銨 硫酸多粘菌素BC19H28O22--1,二甲氧基苯 硫酸多粘菌素B(標(biāo)準(zhǔn)品)C30H50O23,二硝基氟苯 戈氏放線菌探針法熒光PCR檢測(cè)試劑盒糖皮質(zhì)激素受體α(GR-α)ELISA試劑盒Angiopoietin 2 血管生成素2抗體500 ul 糖類抗原199(CA199)ELISA試劑盒Ankyrin G 錨定蛋白G抗體100 ul 糖類抗原125(CA125)ELISA試劑盒ANP 心鈉素抗體20 ul 糖化血紅蛋白A1c(A1c)ELISA試劑盒AT2R 血管緊張素Ⅱ受體抗體100 ul 糖蛋白130(gp130)ELISA試劑盒Angiotensin II 血管緊張素Ⅱ抗體100 ul 碳酸酐酶2(CA-2)ELISA試劑盒ANGPTL2 血管生成素樣蛋白-2抗體1 Kit 碳酸酐酶1(CA-1)ELISA試劑盒ANGPT4/ANG4 血管生成素-4抗體100 ul 胎球蛋白A(Fetuin A)ELISA試劑盒Annexin A1 膜粘連蛋白A1抗體100 ug 胎盤生長(zhǎng)因子(PLGF)ELISA試劑盒Annexin I 膜粘連蛋白 I抗體100 ul |